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PANS|杨朝勇团队发表单细胞全基因组测序新方法实现CNVs精准计数

2023-05-12

导语


单细胞拷贝数变异（CNVs）导致不同水平的基因表达，并解释适应性特征或潜在疾病，在许多疾病研究中可以提示主要动态变化。但CNVs一直受到单细胞全基因组扩增（scWGA）偏倚的阻碍，导致基因拷贝数计数不准确。此外，目前大多数scWGA方法都是劳动密集型、耗时且昂贵的，因此限制了广泛应用。




单细胞测序网讯：5月8日，厦门大学杨朝勇课题组在PNAS发表了题为“
Digital microfluidics-based digital counting of single-cell copy number variation (dd-scCNV Seq)”的文章，概述了一种基于数字微流控技术的自动方法，用于分析单个细胞中的拷贝数变异（CNV）。


这种被称为dd-scCNV Seq的数字计数和微流控方法依赖于 "数字微流控单细胞拷贝数变异数字计数 "文库制备程序，它涉及在一个包含48个电极阵列的数字微流控芯片上分离单细胞，然后进行直接裂解，再加入Tn5转座酶打断基因组DNA，在DNA片段两端添加测序接头，用PCR扩增，再进行磁珠纯化。



因为使用原始单细胞DNA片段作为扩增模板进行单分子扩增，跳过了预扩增，并将重复的片段通过计算过滤，dd-scCNV Seq的数据均一性更高，可实现单分子分辨率的CNV分析。


值得注意的是，dd-scCNV Seq能在4小时内完成单细胞分离、裂解、文库制备与纯化，并且每个样本仅需7美元，极大地节约了时间成本与经济成本。
为了研究用dd-scCNV Seq进行拷贝数分析的准确性，研究者对一个接近三倍体的单个癌细胞（K562细胞)进行了CNV分析。首先采用dd-scCNV Seq和传统的MDA方法获得一个K562细胞的基因组景观，然后分别与Bulk样本的基因组景观进行相互比较。通过Circos图谱分析，dd-scCNV Seq得到的覆盖深度模式与Bulk样本数据相似，因此比MDA扩增更准确。在dd-scCNVSeq（红色标记）中显示的结构变异、重复和缺失也比MDA方法的结果更佳。由dd-scCNV Seq制备的单细胞文库的拷贝数变异在50kb分辨率下进行分析，发现dd-scCNV Seq的扩增和缺失模式与Bulk样本相似，而MDA结果由于预扩增效果较差，与整体结果不一致。dd-scCNV Seq的均匀性和准确性使研究者能够在单细胞中获得具有更高特异性和敏感性的可靠的全基因组CNV模式，确立了将dd-scCNV Seq用于临床癌症样本和产前检测倍性疾病的优势。

研究者还利用dd-scCNV Seq对1例多发性骨髓瘤患者血液中的CD138阳性的骨髓瘤细胞（MMCs）进行CNV分析，结果表明，MMCs与正常骨髓细胞相比，染色体上多个位点都发生了扩增或缺失，而这些信息在Bulk样本中被掩盖。将dd-scCNV Seq测得的CNV位点与FISH的结果进行比较，结果基本一致，且dd-scCNV Seq还发现了FISH未检测出的CNV（8p23.2-21del）。

总的来说，这项研究开发了一种基于数字微流控的单细胞全基因组测序方法，可以更高效、更便宜、更精准地计数单细胞拷贝数变异，具有极大临床应用潜力。

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